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淋巴细胞的分离和计数方法
发布时间:2018-01-08 阅读:125
    淋巴细胞分离是免疫检验的重要考点,各位考生应该熟练掌握,为此,长沙东旺实验仪器有限公司整理了与淋巴细胞分离的相关知识,希望对各位考生有所帮助。
    原理:
    外周血各种血细胞的密度不尽相同,利用淋巴细胞分层液(Ficoll)作密度梯度离心,使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布,从而将各种血细胞加以分离。
    实验设备:
    移液管、1ml移液器、刻度吸管、5ml注射器、EP管、显微镜、离心机。
    实验材料:
    肝素、淋巴细胞分离液、RPMI1640粉末、稀释液(生理盐水)。
    操作流程:
    1.在离心管中加入适量淋巴细胞分离液。
    2.无菌采集静脉血若干毫升,注入盛有肝素的无菌小瓶中,(每1ml全血加0.1ml125-250U/ml肝素溶液),加盖后立即轻轻摇匀,使血液抗凝。
    3.稀释(外周血:稀释液=1:2取肝素抗凝血与等量生理盐水充分混匀)。
    4.用刻度吸管沿倾斜的管壁,把稀释血缓慢叠加于分层液面上,医学/教育网注意保持清楚的界面(Ficoll:稀释血=1:2)。
    5.放入离心机1500r/min离心20min(注:缓慢加速1-4档个3分钟)。
    6.用吸管插到云雾层,吸取单个核细胞。置入另一离心管中,加入5倍以上体积的稀释液(生理盐水),1500rpm×10分钟离心,洗涤细胞。
    7.重复洗涤一次,1500rpm×10分钟离心。
    8.末次离心后,弃上清,加入含有10%小牛血清的RPMI1640,重悬细胞。
    9.计数细胞后再调整细胞置所需浓度。
    10.取一滴细胞悬液与一滴0.2%台盼兰染液混合,于血球计数板上,计数四个大方格内的细胞总数。
    11.分离出的淋巴细胞置于培养瓶中二氧化碳培养箱培养。
    注意事项:
    1.每毫升外周血液大约可获1×106单个核细胞。
    2.温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果。
    3.在Ficoll上加入稀释外周血时,应缓慢加,以免冲散界面。
    4.Ficoll应适量,外周血应充分稀释。
    5.吸取单个核细胞层时,应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染。
    淋巴细胞计数:
    实验流程:
    1.准备计数板。
    2.制备细胞悬液:收集细胞,制成单个细胞悬液。
    3.加样:用吸管轻轻吹打细胞悬液,取少许细胞悬液,在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液。
    4.计数:在显微镜下,用10×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数。
    5.计算:将结果代入下式,得出细胞密度。
    胞数/毫升原=(4大格细胞数之和/4)×104。
 
 
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